Appleton, Wisconsin'de doğdu. Hemşire Muriel Isabel ve doktor William Alfred Dafoe çiftinin 8 çocuğundan biri olan Dafoe, evden çoğunlukla uzakta olan anne ve babasının yokluğunda 5 kız kardeşinin büyük yardımlarıyla büyüdü. University of Wisconsin–Milwaukee'de drama eğitimi almaya başladı, ancak 1 yıl sonrasında okulu bırakarak deneysel bazı tiyatro kumpanyalarına katıldı. 1980'lerin başından itibaren sinema filmlerinde de oynamaya başladı. 1986 yapımı Platoon filmindeki Çavuş Elias rolüyle En İyi Yardımcı Erkek Oyuncu dalında Oscar'a aday gösterildi. 1988'de The Last Temptation of Christ filminde Hz. İsa'yı, 1996'da İngiliz Hasta filminde Kanadalı ajan David Caravaggio'yu canlandırdı. Shadow of the Vampire (2000) gibi filmlerde oynadı. Örümcek Adam film serisinde (2002-2007) Norman Osborn / Yeşil Goblin'i canlandırdı.
2008 yapımı Lars von Trier filmi Antichrist'taki rolüyle Danimarka'nın en önemli ödülü olan Bodil Ödülleri'nde En İyi Erkek Oyuncu ödülünü kazandı. 2014'te yine von Trier'in yönettiği tartışmalı film Nymphomaniac'ta da rol aldı. 2015 yapımı Pasolini filminde de devrinin çok tartışılan yönetmeni Pier Paolo Pasolini'yi canlandırdı. 2017'de rol aldığı The Florida Project ile En İyi Yardımcı Erkek Oyuncu dalında Altın Küre'ye aday gösterildi.
80'li yıllarda yönetmen Elizabeth LeCompte ile birliktelik yaşayan Dafoe'nin 1982 doğumlu Jack adlı bir oğlu vardır. 2005'ten beri İtalyan yönetmen Giada Colagrande ile evlidir.
