Ackles 1978'de Dallas'ta doğdu. Donna Joan ve Alan Ackles çiftinin ortanca çocuğudur. Joshua adlı bir ağabeyi ve Mackenzie adlı bir kız kardeşi bulunmaktadır. Babası Alan da kendisi gibi aktördür. 4 yaşından başlayarak tüm gençliği boyunca modellik yaptı. 1997 yılında Llyod V. Berkener High School'dan mezun oldu. O yıllarda spor hekimliği bölümünü okumak istese de oyuncu olmaktan yana karar kıldı ve Los Angeles'a taşındı.

Çeşitli TV dizilerinde küçük roller aldıktan sonra 1998'de Days of Our Lives adlı diziye Eric Brady rolüyle katıldı. 2 sezon yer aldığı dizide ün kazanan oyuncu, Daytime Emmy Ödülleri'nde En İyi Genç Oyuncu ödülüne adaylıklar kazandı. Bu diziden sonra James Cameron'un Dark Angel adlı dizisi için Vancouver'a gitti. 1 sezon boyunca Alec McDowell rolünü üstlendi. 2003'te bu kez Dawson's Creek adlı dizide C.0.J rolünü oynadı. 2004'te Smallville adlı dizide oynamak için tekrar Vancouver'a geri döndü ve bu dizide Jason Teague adlı karakteri canlandırdı. Son olarak 2005 yılında WB'nin fantastik korku serisi Supernatural'daki Dean Winchester karakteri ile ekranlara geri döndü. Winchester rolüyle birçok ödülün sahibi olan Ackles, halen Smallville'deki rolünü sürdürmektedir.

2006 yılında tanıştığı aktris ve model Danneel Harris ile 2009'da nişanlandı, 2010'da evlendi. 2013 yılında Justice Jay "JJ" Ackles adlı bir kızları oldu.